一、 产品描述

本产品为 STEMCELL Technologies 公司自主研发并生产的专业免疫细胞负向分选试剂，广泛应用于基础医学研究、免疫学机制探索以及细胞治疗等领域的前置样本处理环节。该产品依托成熟的免疫密度分离技术，能够在无需柱纯化或磁力架等特殊设备介入的条件下，实现从人源外周血或白膜层中高效、温和地富集天然杀伤（NK）细胞。

具体产品基础参数如下：

•   中文名称：RosetteSep™ 人 NK 细胞富集抗体混合物

•   英文名称：RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail

•   国际通用货号：提供两种常用规格，分别为 #15025 与 #15065

•   品牌渊源：STEMCELL Technologies，秉承 "Scientists Helping Scientists" 的理念

•   核心规格：货号 #15025 为标准装，内含 2mL 抗体混合物试剂；货号 #15065 为大包装，内含 5 支独立 2mL 试剂（共 10mL），充分满足不同通量与频次的中长期实验规划需求。

•   主要靶点：通过特异性的四聚体抗体复合物，精准识别并靶向结合非 NK 细胞群体及红细胞。

•   适用种属：人（Human）

•   适用样本：肝素钠抗凝的新鲜人外周全血、白细胞单采产物（Leukapheresis）、骨髓样本或白膜层（Buffy coat）。

•   核心技术分类：基于抗体的免疫密度负向分?。↖mmunodensity Negative Selection）。

本品在典型的实验操作中，配合密度梯度离心介质（推荐搭配同品牌 Lymphoprep™ 产品号 #18060 或 RosetteSep™ DM-L 产品号 #15705），可直接从 200mL 全血或其等效体积的白膜层中获取边界清晰的 NK 细胞群。分选后的细胞纯度通常在 80% - 98% 之间（以 CD56+ 细胞占比计），且细胞表面无任何标记物残留，保持了高的生物学活性和天然功能状态。

二、 产品核心特点与优势

1. 操作极简，流程迅捷

   整个实验设计摒弃了传统磁珠分选所需的繁琐洗涤、孵育和过柱步骤。研究人员仅需将本品按比例加入血液样本中简单混匀，随后直接铺入含有密度离心液的离心管内进行单次离心即可。这种极简的操作逻辑不仅大幅缩短了样本处理时间（全过程通?？稍?1.5 小时内完成），也极大降低了因人为操作误差导致样本报废的风险。

2. 免除特殊设备依赖，节约实验室预算

   不同于需要昂贵磁架、复杂流路系统或专门操作培训的分选平台，本产品的实验过程依赖于实验室标配的离心机。这一特性使得该试剂盒具普适性，无论是资源充裕的大型研究中心，还是初创型生物科技企业，均可零门槛快速上手，有效降低科研成本。

3. 温和非接触式分选，保障细胞功能完整性

   作为一种基于“负选"逻辑设计的试剂，其四聚体抗体复合物仅靶向标记不需要的细胞（如 T 细胞、B 细胞、单核细胞、粒细胞及红细胞），而目标 NK 细胞在整个过程中始终保持未标记的原始状态。这种非侵入式的分选策略，确保了分选后的 NK 细胞表面受体不受干扰，为后续开展细胞毒性 assay、细胞培养扩增、基因转导或流式细胞术表型分析等高灵敏度下游功能实验提供了坚实的质量基础。

4. 兼容高通量体系，结果稳定均一

   当与 STEMCELL 的 SepMate™ 离心管联合使用时，能够有效防止离心过程中红细胞层的扰动与返混，实现了高度一致的可重复性结果，特别适合需要处理大体积样本（如 200mL 全血）或追求标准化操作流程（SOP）的工业级应用。

三、 储存条件与保质期

为了保证抗体复合物的生物活性和稳定性，正确的储存方式至关重要。

•   储存温度：本品须在 2°C 至 8°C 的医用冰箱中进行冷藏保存。

•   避光要求：试剂瓶应始终保持在原装盒内或避光环境中，避免光照直射导致蛋白变性。

•   防冻?；ぃ呵形鸾酒防涠常ǖ陀?0°C），冻结会导致抗体空间构象不可逆破坏，致使试剂失效。

•   有效期：在遵守上述储存条件的前提下，产品自生产之日起具有确定的保质期限（具体日期请见产品外包装标签）?？夂?，建议在规定周期内使用完毕，每次取用后应立即拧紧瓶盖并迅速放回冷藏环境。

四、 工作原理详解（免疫密度分离机制）

1. 多重靶向结合与玫瑰花环（Rosette）形成：

   试剂中含有的四聚体抗体复合物具有双重特异性。一方面，它们能够识别并结合存在于非目标细胞（如 T 细胞、B 细胞、单核细胞等）表面的特定抗原；另一方面，这些抗体也能识别红细胞（RBC）表面的特异性分子。在样本孵育阶段，这些抗体就像一把把“分子桥梁"，将各类非 NK 的白细胞与周围的红细胞紧密交联在一起，形成一个个多细胞的聚集体，在细胞生物学中被称为“玫瑰花环"结构。

2. 密度的动态转移：

   正常情况下，淋巴细胞（包括 NK 细胞）的密度较低，在密度梯度离心（如使用 Lymphoprep™）时会漂浮至上层的血浆与分离液界面。然而，那些被抗体交联了众多红细胞的非目标细胞，由于结合了大量的高密度红细胞，其整体的沉降系数显著增加，密度变得远大于常规的淋巴细胞。

3. 差异离心与纯化：

   当样本在密度梯度介质上进行离心时，高密度的“非目标细胞-红细胞"玫瑰花环会克服浮力，穿过密度屏障，与游离的红细胞一起沉降至管底；而未被标记的 NK 细胞由于密度较低，且未结合红细胞，顺利上浮并停留在血浆与密度梯度离心液的交界界面处。研究人员只需吸取该界面的白膜层，即可获得高度富集的 NK 细胞悬液。

通过这种物理密度与免疫学靶向相结合的巧妙设计，实现了在不涉及磁性颗粒或层析柱的情况下，对目标细胞进行高纯度、高得率的分离。

五、 解决的核心实验痛点与科研应用场景

1. 攻克大体积样本处理难题：

   ?   痛点：常规磁珠分选柱的处理通量有限，当面对诸如 200mL 全血或白细胞单采产物时，极易发生柱堵塞，且需要昂贵的大容量专用磁场设备。

   ?   本品对策：基于离心法的物理分离机制，只要离心机转子允许，样本体积几乎不受限。配合大容量离心瓶或 SepMate™ 专用离心管，可轻松、稳定地完成从 40mL 至 200mL 甚至更大体积全血的 NK 细胞富集，非常契合临床级细胞制备的需求。

2. 消除试剂残留对下游功能实验的干扰：

   ?   痛点：许多磁珠分选试剂盒需要在目标细胞上直接偶联抗体或微球，这些外来物质若清洗不净，会阻碍后续的流式抗体染色，或影响 NK 细胞与靶细胞的识别结合，导致细胞毒性实验结果出现严重偏差。

   ?   本品对策：坚持“负选"策略，让 NK 细胞“毫发无损"地通过分离过程。没有荧光标签、没有磁性颗粒、没有交联抗体，细胞处于的“原生态"，适配后续的细胞内细胞因子检测（如 IFN-γ 分泌分析）、信号通路磷酸化研究以及体内外杀伤功能验证。

3. 提升珍贵临床样本的利用率与活性：

   ?   痛点：某些罕见病患者或特定动物模型采集到的血液样本极为有限，传统方法繁琐的洗涤和离心步骤容易造成细胞机械损伤和黏附损失，导致最终获得的细胞数量不足以支撑下游实验。

   ?   本品对策：直接将抗凝全血加入试剂混匀即可上机离心，极大减少了样本转移和开盖次数。封闭的系统（如配合 SepMate™ 试管）还能降低气溶胶污染风险，最大限度地回收珍贵的原生细胞。

主要研究领域与应用方向：

•   NK 细胞生物学研究：探究 NK 细胞的发育、亚群分布及功能调节机制。

•   肿瘤免疫学与细胞治疗：作为 CAR-NK 疗法开发中的起始细胞富集步骤，或在体外扩增前获取高纯度种子细胞。

•   感染免疫学：研究 NK 细胞在抗病毒（如 SARS-CoV-2 等）免疫反应中的激活状态与清除机制。

•   免疫监测与诊断：从患者外周血快速富集 NK 细胞，用于后续的免疫表型分析或细胞因子分泌谱检测。

六、 标准实验操作流程（Step-by-Step Guide）

为了确保您获得最佳的实验结果，请务必在开始实验前仔细阅读并理解以下操作步骤。建议整个操作过程在室温（18°C - 25°C）下进行，所用试剂需提前平衡至室温。

第一部分：实验前准备

1. 试剂平衡：从 4℃ 冰箱取出 RosetteSep™ 人 NK 细胞富集抗体混合物、密度梯度离心液（如 Lymphoprep™ 或 RosetteSep™ DM-L）以及 DPBS（含 2% 胎牛血清），置于室温下静置平衡至少 30 分钟。

2. 样本准备：采集健康供体的新鲜外周全血，必须使用肝素钠（Heparin）作为抗凝剂。如果使用之前冷冻保存的样本，需先复苏并将细胞浓度调整为 2 - 5 x 10^7 cells/mL，并补充加入 2% FBS。

3. 设备预热：确保离心机转子处于室温环境。

第二部分：抗体孵育与离心分离

1. 抗体添加：根据您的样本体积，按照试剂盒说明书推荐的比例，将 RosetteSep™ 抗体混合物直接加入到全血或白膜层样本中。轻轻上下吹吸混匀，切勿剧烈涡旋震荡。

2. 孵育：将混合好的样本在室温下静置孵育 15 至 20 分钟。此步骤旨在让抗体充分结合靶细胞并形成稳定的玫瑰花环结构。

3. 铺设密度梯度离心液：取一支干净的离心管（若处理大体积样本，推荐使用 SepMate™-50 离心管），向管中加入预先计算好体积的浓度梯度离心液。

4. 样本叠加：将孵育好的血液样本非?；郝?、沿管壁逐滴加入到密度梯度离心液的上层。注意尽量避免两层液体发生混合，保持清晰的液面分界。

5. 离心分层：将离心管对称放入转子中，设定离心机为室温，以 800g - 1000g 的加速度进行 15 至 20 分钟的离心（具体参数视离心机型号和样本体积微调）。

6. 收集目标细胞：离心结束后，小心取出离心管。此时管底为沉积的红细胞和不需要的白细胞，中间为透明/半透明的密度梯度离心液，最上层为血浆层。目标 NK 细胞富集在密度梯度离心液与上层血浆的狭窄交界面处（呈云雾状白膜层）。使用移液器小心吸取该界面层，转移至一个新的洁净离心管中。

第三部分：洗涤与重悬

1. 稀释样本：向收集到的界面细胞悬液中加入适量预冷的 DPBS（含 2% FBS）进行稀释，以降低密度梯度介质的粘度。

2. 二次离心：在 4℃ 条件下，以 300g - 400g 离心 5 - 10 分钟，弃去上清液（注意不要触及管底细胞沉淀）。

3. 重悬计数：用适量的预冷 DPBS（含 2% FBS）或培养基重悬细胞沉淀。取少量细胞进行台盼蓝染色计数，评估细胞活率和浓度；另取部分细胞进行流式细胞术分析（如检测 CD56 表达），以确定 NK 细胞的富集纯度。

七、 常见问题深度剖析与解决方案（Troubleshooting）

问题 1：目标 NK 细胞的回收率（得率）低于预期

•   可能原因 1：试剂或样本温度过低。

   ?   深度解析：低温会导致红细胞变硬，影响其柔性，从而降低抗体介导的细胞交联效率，使得部分非目标细胞未能形成足够密度的聚集体，在离心时错误地进入了目标界面层，间接导致目标细胞层被稀释或丢失。

   ?   解决方案：严格执行室温平衡步骤。确保所有涉及反应的试剂（抗体、密度液、PBS）以及离心机转子均处于 18°C - 25°C 的室温环境。

•   可能原因 2：样本细胞浓度过高。

   ?   深度解析：如果样本中核细胞浓度超过 5 x 10^7 cells/mL，抗体分子可能无法在有效时间内充分接触到所有靶细胞，导致交联不全。

   ?   解决方案：在添加抗体前，使用 PBS + 2% FBS 将样本稀释，确保细胞浓度处于试剂盒推荐的最佳线性范围内。

•   可能原因 3：吸取界面层时操作不当。

   ?   深度解析：吸取上清时吸入了过多的上层血浆，或者丢弃上清时误吸掉了管底的珍贵细胞沉淀。

   ?   解决方案：优化移液器操作手法，建议更换新的无菌吸头进行多次少量吸取。在肉眼难以分辨时，可预留少量液体在管底，确保不丢失沉淀。

问题 2：分选后的 NK 细胞纯度不高（夹杂过多其他淋巴细胞）

•   可能原因 1：样本叠加时发生湍流混合。

   ?   深度解析：在将血液样本铺加到密度梯度离心液上时，如果手法过快或角度不对，导致两层液体提前混合，破坏了密度梯度的稳定性，使得非目标细胞未能有效沉降。

   ?   解决方案：放慢加样速度，可以使用移液器将样本贴壁缓慢滴加，或者使用长颈移液管伸入管底上方缓慢释放样本，保持两层液体的绝对清晰界限。

•   可能原因 2：离心力或离心时间设置不当。

   ?   深度解析：离心力过大或时间过长，可能会将一些密度稍低的非目标细胞强行压入界面层；反之，离心不足则可能导致红细胞去除不干净。

   ?   解决方案：根据离心机半径，精确计算所需的相对离心力（RCF），并严格控制离心时间。建议进行预实验以确定该批次样本的最佳离心参数。

问题 3：最终产物中出现红细胞（RBC）污染

•   可能原因 1：抗体比例不足或红细胞数量不够。

   ?   深度解析：该体系依赖于足量的红细胞作为“沉降砝码"。如果样本中红细胞比例异常偏低（例如某些贫血患者的样本，或过度稀释的样本），非目标白细胞无法形成足够密度的聚集体，从而残留在界面层。

   ?   解决方案：严格按照说明书的体积比例添加抗体。若处理的是分离过白膜层或冻存复苏的样本，务必按说明书指示，补充加入适量新鲜的肝素抗凝全血作为红细胞来源（通常为 250 µL 每 mL 样本）。

•   可能原因 2：离心管底沉淀受到扰动。

   ?   深度解析：在吸取界面层细胞时，移液器吹打产生的涡流搅动了底部致密的红细胞沉淀，导致下层液体混入上层。

   ?   解决方案：吸取时保持移液器吸头始终处于界面层的中上部。若使用 SepMate™ 离心管，其有的多孔屏障能有效隔离沉淀，大幅降低此风险。如果手动吸取，动作需极其轻柔。对于极其轻微的红细胞污染，可在收集后进行一次低渗裂解（如使用 ACK 裂解液）以去除残留的红细胞。

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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